后固定：胃蛋白酶---后才需要。固定液为1%---/0.1 m pbs（ph7.2-7.6），含有1/1000 depc。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
原位杂交的预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，植物叶片原位杂交技术服务，不洗。
杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专1用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×ssc洗涤5分钟×2次；37℃0.5×ssc洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×ssc洗涤15分钟×1次(如果有非特---染色，重复0.2×ssc洗涤15分钟×1-2次)。
阻断内源性---化物酶：滴加3%1甲1醇-h2o2，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
预杂交：滴加预杂交液，37°c孵育1h。
杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-st6galnac6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。
杂交后洗涤：洗去杂交液，2×ssc，37°c 洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加---胺洗涤。
滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。
滴加鼠抗地1高辛标记---化物酶（anti-dig-hrp）：倾去封闭液，滴加anti-dig-hrp。37°c孵育50min，后pbs洗3次×5min。
原位杂交
实验原理
原位杂交技术（in situhybridization）是以标记的---分子为探针，在组织细胞原位检测特异---分子的技术。
使含有特异序列、经过标记的---单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补---单链即靶---发生杂交，再以自显影或细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的dna或rna分子。
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