植物基因组原位杂交检测服务-科锐诺

原位杂交第三天

1） 用1ml含10%热灭清的mabt溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlmabt置换，25分钟，再用1mlmabt溶液置换，一小时以上，后用1mlmabt溶液置换，25分钟。

2） 用1ml 1mm左旋米睉的staining buffer洗三次，每次放置五分钟。

3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul bm purple ap substrate（底物，用之前加5mm左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。

4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色

5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用pbst洗两三次后加上4%---固定，拍照。

6）4c冰箱保存。

阻断内源性---化物酶：滴加3%1甲1醇-h2o2，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

预杂交：滴加预杂交液，37°c孵育1h。

杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-st6galnac6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，植物基因组原位杂交检测服务，恒温箱37度杂交过夜。

杂交后洗涤：洗去杂交液，2×ssc，37°c 洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加---胺洗涤。

滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。

滴加鼠抗地1高辛标记---化物酶（anti-dig-hrp）：倾去封闭液，滴加anti-dig-hrp。37°c孵育50min，后pbs洗3次×5min。