分子病理技术服务-科锐诺生物

将少数菌落转移到纤维素滤膜上

（1） 在含有选择性的琼脂平板上放一张纤维素滤膜。

（2） 用无菌---将各个菌落先转移至滤膜上，再转移至含有选择性但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种（或打点）。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒的菌落。

（3） 倒置平板，于37℃培养至划线的---菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。

（4） 用已装防水黑色绘图墨水的针头穿透滤膜直至琼脂，在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。

（5） 用parafilm膜封好主平板，倒置贮放于4℃，直至获得杂交反应的结果。

（6） 裂解---，按本段下面所述方法，使释放的dna结合于纤维素滤膜。

原位杂交（in situ hybridization）将标记的---探针与细胞或组织中的---进行杂交，称为原位杂交。使用dna或者rna探针来检测与其互补的另一条链在---或其他真核细胞中的位置。rna原位---杂交又称rna原位杂交组织化学或rna原位杂交。该技术是指运用crna或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内rna表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的rna核苷酸片段，按---杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体 (hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mrna、rrna和trna分子。rna原位杂交技术 经不断改进，其应用的领域已---出dna原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，分子病理技术服务，已 成为有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mrna表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

癌组织原位杂交实验步骤：

       1. 将准备做原位杂交的样本常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。

       2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或apes。

       3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%h2o2 1份+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

       4. 暴露mrna---片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温---3--30分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。原位杂交用pbs洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

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