植物rna原位杂交测试服务-武汉科锐诺生物

原位杂交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的pbst溶液，放置5分钟。

2） 置换成30%的pbst溶液，放置5分钟

3） 置换成pbst溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4%---的pbs溶液固定20分钟5） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶k在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，植物rna原位杂交测试服务，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用pbst溶液轻洗，在pbst中放置5分钟。

3） 用4%---的pbs溶液固定20分钟，室温。

4） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

1）每个管中置换成大约300ulhyb－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的hyb+取代hyb－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

1）吸去预杂交的hyb+，加上100ul已加入探针的hyb+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

应用于分子病理诊断的dna测序技术有直接测序法和焦磷酸测序法。直接测序技术主要是sanger等发明的双脱氧链末端终止法。其原理就是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生a、t、c、g4组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的page胶上电泳进行检测，从而获得dna序列。直接测序法是基因突变检测的“金标准”，其优点是结果准确，重复性好，可检测整个测序范围内已知和未知突变点;缺点是步骤多，耗时长，灵敏度低，过程不易控制，在检测已知突变位点方面将逐渐被荧光定量pcｒ法替代。

分子病理学是与分子生物学、细胞遗传学等学科相互渗透，在蛋白质和---等生物大分子水平上研究---病因、发病机制、形态变化及功能损害等方面发生和发展规律的新的分支学科，对---的病因、发展、发病机制及形态变化，从传统形态学概念深入至分子或基因水平，分子病理已成为肿1瘤病理研究中重要的内容和手段。细胞特---mrna转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；

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