植物组织rna原位杂交检测技术服务-武汉科锐诺生物

原位杂交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的pbst溶液，放置5分钟。

2） 置换成30%的pbst溶液，放置5分钟

3） 置换成pbst溶液，放置5分钟，重复一次

4） 置换成4%---的pbs溶液固定20分钟5） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶k在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2） 用pbst溶液轻洗，在pbst中放置5分钟。

3） 用4%---的pbs溶液固定20分钟，室温。

4） 用pbst洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

1）每个管中置换成大约300ulhyb－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的hyb+取代hyb－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

1）吸去预杂交的hyb+，加上100ul已加入探针的hyb+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

原理

原位杂交技术是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的---复性结合而使得组织细胞中的特------得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在---的原有位置上显示出来。

经特定标记的核苷酸链为探针，可与组织切片、细胞或染色体标本中的待检dn---段或mrna进行杂交，然后显示标记物，从而分析待检---的分布和含量。利用此项技术可研究各种基因在染色体上的定位，编码某种蛋白质的mrna在胞质中的表达。