阻断内源性---化物酶：滴加3%1甲1醇-h2o2，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs（ph7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
预杂交：滴加预杂交液，37°c孵育1h。
杂交：倾去预杂交液，滴加含探针has-circ-st6galnac6 probe 杂交液，浓度6ng/ul，恒温箱37度杂交过夜。
杂交后洗涤：洗去杂交液，植物组织原位杂交检测技术服务，2×ssc，37°c 洗10min，1×ssc，37°c洗2×5min，0.5×ssc室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加---胺洗涤。
滴加封闭液：滴加封闭血1清（正常兔血1清），室温30min。
滴加鼠抗地1高辛标记---化物酶（anti-dig-hrp）：倾去封闭液，滴加anti-dig-hrp。37°c孵育50min，后pbs洗3次×5min。
滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。
.滴加生物素化鼠抗地1高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用pbs洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
滴加sabc：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用pbs洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
滴加生物素化---化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用pbs洗5分钟×4次。
dab显色：使用dab显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂ａ，ｂ，c各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配dab显色剂后显色。充分水洗。
.苏1木素复染，充分水洗。
酒精脱水，二甲1---透明，封片。
原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎，在holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%---固定，在4℃保存，二十四小时后用50%2%---溶液洗，然后换成，在-20c 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用处理，去除色素。或者使用---锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成） 武汉科锐诺生物科技有限公司
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